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詳細(xì)解讀美國伯樂熒光定量PCR的工作原理
點(diǎn)擊次數(shù)：2875 更新時(shí)間：2021-12-09
 
　　美國伯樂熒光定量PCR(Real-timePCR)，是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過對擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時(shí)檢測,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
 
　　美國伯樂熒光定量PCR工作原理：
 
　　以探針法熒光定量PCR為例：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個特異性的熒光探針，該探針兩端分別標(biāo)記一個報(bào)告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。開始時(shí)，探針完整地結(jié)合在DNA任意一條單鏈上，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。
 
　　傳統(tǒng)的PCR進(jìn)行檢測時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)后需要進(jìn)行染色處理及電泳分離，并且只能作定性分析，不能準(zhǔn)確定量，易造成污染出現(xiàn)假陽性，使其應(yīng)用受到限制。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對模板的定量，且具有靈敏度高、特異性和可靠性更好、自動化程度高和無污染的特點(diǎn)，使得熒光定量PCR逐漸取代常規(guī)PCR。
 
　　在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即是基線，這條線是可以自動生成也可以手動設(shè)置的。之后反應(yīng)會進(jìn)入指數(shù)增長期，這個期間擴(kuò)增曲線具有高度重復(fù)性，在該期間，可設(shè)定一條熒光閾值線，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般會將熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值，這個值與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系，且該值具有重現(xiàn)性。